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CP-1® High Grade 技術情報

ホーム細胞培養(製品一覧)CP-1® High Grade 技術情報

造血幹細胞をはじめ、各種細胞用の凍害保護液

  • ・再生医療等製品材料適格性確認済み
  • ・1992年から続く使用実績
  • ・国内のGMP対応施設にて製造
  • ・非臨床試験実施済み
  • ・-80℃のフリーザーで凍結保存が可能
  • ・動物由来原料 不含
  • ・組成を開示
  • ・原薬等登録原簿(MF)登録済み

CP-1® High Grade

製品コード 製品名 用途 容量 貯法 希望小売価格
27207 CP-1® High Grade 造血幹細胞、間葉系幹細胞、
その他細胞の凍害保護液
50 mL×2 室温 10,800円
27206 100 mL×2 18,000円
使用説明書 プロトコル SDS リーフレット
-

組成情報

ヒドロキシエチルスターチ
ジメチルスルホキシド
生理食塩水

CP-1® High Gradeで凍結可能な細胞例

付着系細胞
ヒトiPS細胞 PFX#9 ヒトES細胞 H9
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞 MSC-AT ヒト骨髄由来間葉系幹細胞 MSC-BM
ヒト新生児由来皮膚繊維芽細胞 NHDF-Neo ヒト胎児腎臓由来細胞 HEK293
チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO-K1 ヒト骨芽細胞 Human Osteobrast
浮遊系細胞
マウスハイブリドーマ SJK-287-38
ヒト造血幹細胞
(ヒト末梢血幹細胞、ヒト臍帯血幹細胞、ヒト骨髄幹細胞)
 

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実施例

Ⅰ.浮遊系細胞と付着系細胞の凍結方法

Ⅱ.CP-1® High Gradeを用いた造血幹細胞の凍結保存・解凍方法

手順の詳細は “使用説明書” をご確認ください。

Ⅲ.CP-1® High Gradeを用いた間葉系幹細胞の凍結保存・解凍方法

手順の詳細は “CP-1® High Gradeプロトコル集” をご確認ください。

凍結保存液の調製

  • 1. CP-1® High Grade, 25% HSA, 培地を4℃で冷やす。
  • 2. CP-1® High Grade 6.8 mL, 25%HSA 3.2 mL, 培地 10.0 mLを遠心管に加え、均一に混和する。
  • 3. 使用直前まで 4℃にて保管する。

細胞の凍結保存

  • 1. 凍結保存する細胞を剥離液などで回収し、細胞数を計数する。
  • 2. 遠心により上清を除去する。
  • 3. あらかじめ4℃に冷やしておいたCP-1® High Grade/25% HSA/培地(凍結保存液の調製-2)を加え、
      1×106 cells/mLになるように均一に縣濁する。
  • 4. 1 mLずつクライオチューブに分注し、フリージングコンテナに入れ、-80℃で緩慢凍結する。
  • 5. 翌日に液体窒素または-150℃ディープフリーザーへ移す。

細胞の解凍

  • 1. あらかじめ培地9 mLを遠心管に準備しておく。
  • 2. 凍結していたクライオチューブを液体窒素から取り出し、37℃の温浴で急速解凍する。
  • 3. 解凍した細胞全量を培地へ加え、遠心する。
  • 4. 上清を除去し、適量の培地を加える。
  • 5. 使用する細胞種毎の最適な条件にて培養を行う。

Ⅳ.評価結果(間葉系幹細胞を用いた凍結保存 検討)

(兵庫医科大学 山原研一先生との共同研究、特許出願中)

【目的】 今後の再生医療への利用が期待されるヒト間葉系幹細胞(hMSC)について、CP-1® High Gradeで凍結保存し、安価かつ簡便なドライアイスで安定的に長期輸送が可能か検討した。

【方法】 ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(MSC-AT)またはヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC-BM)をCP-1® High Gradeもしくは対照(下図A)にて凍結し(1 x 106 cells/mL)、液体窒素タンクで保管した。液体窒素タンクで保管後、ドライアイス輸送を想定した各条件下で保管し(-80℃・7日間, -60℃・3日間, 60℃・7日間)、解凍直後の生存率および翌日の培養器への接着率を確認した(接着率=生細胞数/播種生細胞数)。

【結果】 全ての条件において、解凍直後の生存率は90%以上であり、差異は認められなかった(下図B)。しかし、対照で凍結したhMSCでは-60℃で保存すると解凍翌日に培養器へ接着しない死細胞が多数認められたが、CP-1で凍結したhMSCでは死細胞がほとんど認めらず、ほぼ全ての細胞が接着していた(下図B,C)。

【結論】 ドライアイスそのものの温度は約-80℃であることから、CP-1® High Gradeで凍結したhMSCはドライアイスを用いて安定的かつ長期的に輸送することが可能だと考える。

A. 凍害保護液の組成

B. 解凍直後の生存率および翌日の接着率

B. 解凍直後の生存率および翌日の接着率

C. 培養翌日の細胞の様子

C. 培養翌日の細胞の様子

Ⅴ.CP-1® High Gradeによるヒト多能性幹細胞の凍結

(神戸医療産業都市推進機構(川真田先生)において取得いただいたデータを一部抜粋)


【概要】
CP-1®High Grade を用いてヒト多能性幹細胞を緩慢凍結できるかどうかを検討するため、CP-1®High Gradeで凍結保存したヒトiPS細胞またES細胞を融解し、培養した際の増殖能および未分化状態を評価した。またこれまでのCP-1®High Gradeの使用方法では、使用前にヒト血清(HSA)を添加していたが、HSAはヒト由来成分であるため添加しないことが求められる場合もある。そこで、今回の検討では、HSAを添加せずにiPS/ES細胞が凍結保存できるかについても検討した。
結果、CP-1®High Gradeで凍結したiPS/ES細胞の増殖能は、市販品と同等であり、未分化状態も維持されていることが示された。つまりCP-1®High Gradeは、ヒト多能性幹細胞の凍結においても使用可能であることが確認できた。

詳細はこちら

  • CP-1® High Gradeで凍結したヒトiPS細胞の融解後評価

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参考資料

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FAQ

Q1. CP-1® とCP-1® High Gradeの違いはなんでしょうか?

組成や性能は変わりません。より安全性の高い原料への変更と製造場所(GMP対応施設)の変更となります。

Q2. どれくらいの期間、凍結保管できますか?

安定した条件であれば、-80℃でも1年程度は保管可能です。それ以上保管する場合は、液体窒素または-151℃を推奨します。

Q3. 25%ヒト血清アルブミンの代わりに20%ヒト血清アルブミンを使用できますか?

20%ヒト血清アルブミンもしくは自己血漿(凍結する細胞と同一由来の血漿)で代用することはできます。
これらを使用する場合にも、添加量は同量としてください。

Q4. CP-1® High Gradeの保管温度は何℃ですか?

2~30℃で保管してください。長期冷蔵保管をすると成分が析出する場合がありますので、長期冷蔵保管は避けてください。

Q5. 操作上の注意点は?

本品とヒト血清アルブミン(HSA)の混和時、およびHSA加本品と細胞懸濁液の混和時に発熱を伴う場合があります。
そのため、混和の際には氷上でおこなうか、あらかじめ冷やした本品を使用してください。また、HSA添加後は速やかに使用してください。
詳しい手順は使用説明書およびプロトコルをご確認ください。

Q6. 細胞懸濁液の調製には何を使用したらいいのか?

凍結保存する細胞の培養液(例:RPMI1640)、もしくは生理食塩水を用いて調製してください。

Q7. 至適な細胞密度(細胞濃度)は?

造血幹細胞を凍結保存する場合は、最終濃度1 x 108 cells/mL 程度に調製してください。
間葉系幹細胞を凍結保存する場合は、最終濃度1 x 106 cells/mL程度で保管した実績があります(実施例Ⅲ)。

Q8. 細胞の凍結速度は?

-2~-3℃/分程度が目安です。-5℃/分を超えないことが望ましいです。

Q9. 造血幹細胞以外の細胞の凍結保存に関する情報は?

ヒト骨髄由来およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いた凍結保存の検討結果を掲載中です。実施例Ⅲをご確認ください。
また、造血幹細胞以外の細胞における凍結保存方法は、プロトコルを参照ください。

Q10. 骨髄液の凍結保存はできますか?

骨髄液中の造血幹細胞を保存するといった目的であれば、原理的には使用可能ですが、赤血球と顆粒球の除去が必要です。

Q11. どのようにすれば購入できますか?

当社代理店からご購入いただけます。代理店一覧はこちらでご確認いただけます。

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