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Pronase/EDTA for Stem 技術情報

ホーム細胞培養(製品一覧)Pronase/EDTA for Stem 技術情報

ヒトiPS/ES細胞の分散液として最適化

  • ・オンフィーダー培養、フィーダーレス培養両方に使用可 New!
  • ・シングルセルから均一な細胞塊まで分散の状態を調整可 New!
  • ・Ready-to-Use
  • ・動物由来原料不含

【特許取得】
特許第5804437号 幹細胞保存媒体 幹細胞保存方法および幹細胞保存システム(極東製薬工業株式会社/理化学研究所)

Pronase/EDTA for Stem

製品コード 製品名 用途 容量 貯法 希望小売価格
28111 Pronase/EDTA for Stem iPS/ES細胞用分散液 100 mL -15℃以下 12,000円
使用説明書 プロトコル SDS リーフレット
-

組成情報

75 mg/L プロナーゼ
0.2 mM EDTA
D-PBS (―)
  • 実施例
  • 参考資料
  • FAQ

実施例

1. CP-5E & Pronase/EDTA for Stemを用いた凍結保存法の検証

融解後の高い生存率・ALP染色陽性・増殖能に変化がないことを確認しています。また、未分化状態維持マーカーの発現・分化能・染色体の安定性が確認されており、凍結融解前後で細胞の性質が変化しないことを明らかにしました。(詳細は“ 第87回 日本組織培養学会 ポスター発表” をご確認ください)

  • A.ヒトiPS/ES細胞 各2株における凍結融解後の生存率

    A. ヒトiPS/ES細胞 各2株における
    凍結融解後の生存率

  • B.凍結融解前後のALP染色陽性像 (ヒトiPS細胞株 201B7)

    B. 凍結融解前後のALP染色陽性像
    (ヒトiPS細胞株 201B7)

  • C.凍結融解前後における増殖曲線 (ヒトiPS細胞株 201B7.青;凍結前、赤;凍結融解後)

    C. 凍結融解前後における増殖曲線
    (ヒトiPS細胞株 201B7.青;凍結前、赤;凍結融解後)

●ヒトiPS/ES細胞の凍結保存・融解方法の手順の詳細は、下記をご確認ください。
1)オンフィーダー培養の場合は、“使用説明書” へ。
2)フィーダーレス培養の場合は、“Pronase/EDTA for Stemプロトコル集” へ。New!

2. オンフィーダー培養したヒトiPS細胞の継代 New!

  • 1. 培地を吸引除去し、PBS(-)で洗浄する。
  • 2. あらかじめ37℃に温めたPronase/EDTA for Stemを加える。
  • 3. インキュベーター内で2~5分間静置し、細胞を剥離・分散する。
  • 4. 先に剥離してくるSNLフィーダー細胞を吸引除去した後、PBS(-)で洗浄する。
  • 5. 培地を加え、セルスクレーパーにてコロニーを培養容器から剥がす。
  • 6. 回収した細胞縣濁液を遠心チューブに移す。
  • 7. 必要に応じて培地を加え、新しいフィーダー細胞上に細胞を播種する。
  • 8. 48時間後、培地交換を行う。
  • 9. 3日後以降は適宜培地を交換し、適度なサイズのコロニーになるまで培養する。

注意点

  • ・細胞を剥離,分散する際の処理時間は、フィーダーの状態や細胞株によって異なります。
    ご自身の培養環境における条件設定を行ってからご使用ください。
  • ・処理時間が長すぎると細胞塊が小さくなりすぎるため、播種後の培養時間の長期化や初期接着
    不良等が起こる可能性があります。凍結保存に用いるよりも短時間での処理をお勧めします。
  • オンフィーダー培養したヒトiPS細胞株 201B7の継代の様子

オンフィーダー培養したヒトiPS細胞株 201B7の継代の様子
Pronase/EDTA for Stemを用いてオンフィーダー培養したヒトiPS細胞の継代ができることを確認しました。
細胞塊をフィーダー上に播種後、約1週間で次の継代が可能であることを確認しました(Scale bar; 500 μm)。

●手順の詳細は“Pronase/EDTA for Stem プロトコル集” をご確認ください。

3. フィーダーレス培養したヒトiPS細胞の継代 New!

3-1) フィーダーレス シングルセルフラット培養したヒトiPS細胞の場合

  • 1. 培地を吸引除去し、PBS(-)で洗浄する。
  • 2. あらかじめ37℃に温めたPronase/EDTA for Stemを加える。
  • 3. インキュベーター内で2~5分間静置し、細胞を剥離・分散する。
  • 4. 培地を加え、ピペッティングにて細胞を培養容器から剥がし、シングル化する。
  • 5. 回収した細胞縣濁液を遠心チューブに移し、遠心(400×g, 3分, 4℃)後、上清を除去する。
  • 6. ROCK阻害剤添加培地を加え、あらかじめECMコートした新しいディッシュ上に細胞を播種する。
  • 7. 翌日、ROCK阻害剤非添加の培地に交換し、その後、毎日培地を交換する

注意点

  • ・細胞を剥離,分散する際の処理時間や細胞播種密度は、細胞株によって異なります。
    ご自身の培養環境における条件設定を行ってからご使用ください。
  • ・播種時は必ずROCK阻害剤を添加した培地をご使用ください。
  • フィーダーレス シングルフラット培養したヒトiPS細胞株 201B7継代の様子

フィーダーレス シングルフラット培養したヒトiPS細胞株 201B7継代の様子
Pronase/EDTA for Stemを用いて継代し、フィーダーレス シングルフラット培養したヒトiPS細胞は、初期接着、増殖ともに良好であり、
ALP染色陽性であることを確認しました(Scale bar;500 μm, 細胞播種数 2 × 105 cells/well, 6-wellプレート)。

●手順の詳細は“Pronase/EDTA for Stem プロトコル集” をご確認ください。

3-2) フィーダーレス クランプセル培養したヒトiPS細胞の場合 New!

  • 1. 培地を吸引除去し、PBS(-)で洗浄する。
  • 2. あらかじめ37℃に温めたPronase/EDTA for Stemを加える。
  • 3. 室温で2分程度静置し、細胞間の接着が緩む程度まで処理する。
  • 4. Pronase/EDTA for Stemを除去し、PBS(-)で洗浄する。
  • 5. 培地を適量添加し、ディッシュから細胞を剥がす。
  • 6. 細胞を遠心チューブに回収し、ピペッティングにより適度な大きさのクランプを形成する。
  • 7. あらかじめECMコートした新しいディッシュ上に細胞を播種する。
  • 8. 48時間後に培地交換する。その後は2日に一度、培地交換を行う。

フィーダーフリー クランプセル培養したヒトiPS細胞株PFX#9の継代の様子

フィーダーフリー クランプセル培養したヒトiPS細胞株PFX#9の継代の様子

フィーダーフリー クランプセル培養したヒトiPS細胞株PFX#9の継代の様子
Pronase/EDTA for Stemを用いてフィーダーフリー培養したヒトiPS細胞の継代ができることを確認しました。細胞塊を新しいプレート上に播種後、4~6日程度で次の継代が可能であることを確認しました(Scale bar; 500μm)。

注意点

  • ・細胞を剥離,分散する際の処理時間や細胞播種密度は、細胞株によって異なります。
    ご自身の培養環境における条件設定を行ってからご使用ください。

●手順の詳細は“Pronase/EDTA for Stem プロトコル集” をご確認ください。

4. オンフィーダー培養ヒトiPS細胞のシングル化の検討

  • 1. 培地を吸引除去し、PBS(-)で洗浄する。
  • 2. あらかじめ37℃に温めたPronase/EDTA for Stemを加える。
  • 3. 37℃インキュベーター内で1~3分間静置する。
  • 4. 先に剥離してくるSNLフィーダー細胞を吸引除去した後、PBS(-)で洗浄する。
  • 5. 新しいPronase/EDTA for Stemを加え、37℃インキュベーター内で3~10分間静置する。
  • 6. 培地を加え、ピペッティングにて細胞を培養容器から剥がし、シングル化する。
  • 7. 回収した細胞縣濁液を遠心チューブに移す。
  • 8. 遠心(300×g、5分、4℃)後、上清を除去する。
  • 9. 培地を加え、ピペッティングにて再懸濁する。
  • A.Pronase/EDTA for Stem処理後3分の細胞の様子

    A. Pronase/EDTA for Stem処理後3分の細胞の様子

  • フィーダーレス シングルフラット培養したヒトiPS細胞株 201B7継代の様子

    B. 遠心・再縣濁後の様子

オンフィーダー培養ヒトiPS細胞株 201B7のシングル化の様子
Pronase/EDTA for Stemを用いてフィーダー細胞を除去した後に、さらにPronase/EDTA for Stemで処理することにより、
オンフィーダー培養したヒトiPS細胞のシングル化ができることを確認しました(Scale bar; 500 μm)。

●手順の詳細は“Pronase/EDTA for Stem プロトコル集”をご確認ください。

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参考資料

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FAQ

Q1. プロナーゼの由来は何ですか?

放線菌(Streptomyces griseus)が分泌するプロテアーゼの混合物で、広範囲な基質特異性を持っています。

Q2. 動物由来原料は使用していますか?

使用していません。

Q3. 保管・使用上の注意はありますか?

-15℃以下で保管してください。到着後、一度融解し小分けにして凍結保存して使用ください(凍結融解は繰り返さないでください)。使用する前に必要量をチューブ等に分取し、37℃のウォーターバスで温めてください。

Q4. 「極東プロナーゼ溶液」と「Pronase/EDTA for Stem」の違いは何ですか?

細胞の剥離時間を5分程度と伸ばし、ハンドリングしやすいように改変しました。EDTA濃度が「極東 プロナーゼ溶液」の1/3となっています。

Q5. Pronase/EDTA for Stemで処理した後の細胞塊の細胞数はどれくらいですか?

37℃インキュベーターで2~5分静置後、10~20個程度となり、処理時間を長くした場合、シングルセルの割合が増加します。1~10個程度でも保存可能ですが、融解後適度なコロニーのサイズになるまで培養日数が長くなります。

Q6. Pronase/EDTA for Stemを使ってiPS/ES細胞をシングル化できますか?

条件を変更することで、オンフィーダー培養したヒトiPS細胞のシングル化ができることを確認しています(実施例4 へ)。

Q7. どこから購入できますか?

当社代理店からご購入いただけます。代理店一覧はこちら でご確認いただけます。

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